实验原理：本实验通过从动物体内提取不同组织，经过各种酶（通常使用胰蛋白酶）、螯合剂（如EDTA）或机械方法进行处理，分散为单个细胞，并将其培养于适宜的培养基中，使细胞得以存活、生长和繁殖，此过程称为原代培养。当细胞在培养瓶中生长形成紧密单层且即将达到饱和时，为了促进细胞的继续生长并扩大数量，必须进行传代（再培养）。传代培养不仅是保存细胞的重要方法，也是进行多种实验的必要环节。悬浮型细胞可直接分瓶，而贴壁细胞则需经过消化后方可分瓶。

实验仪器：本实验需要用到培养箱（设置至37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机和水浴箱（37℃）。

实验试剂：所需的实验试剂包括1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank's液、碘酒和75%酒精。

实验步骤

一、原代细胞培养步骤

1. 准备：在净化台面上准备各种已消毒的培养用品，并进行紫外线消毒20分钟。开始操作前，洗手并用75%酒精擦拭手部至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯并安装吸管帽。

3. 处理组织：将组织块放入烧杯中，用Hank's液漂洗2-3次以去除血污；如怀疑存在污染，可先置于含青链霉素的混合液中浸泡30-60分钟。

4. 剪切：用眼科剪将组织剪成2-3毫米大小的小块以便于消化，加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液，并倒入三角烧瓶中，封口。

5. 消化：在恒温水浴或37℃培养箱中进行消化，每隔20分钟轻轻摇动一次，消化时间根据组织的大小和硬度而定。

6. 分离：消化液开始混浊时，用吸管吸出少许液体在显微镜下观察，当观察到组织已分散为细胞团或单个细胞时，立即停止消化，过滤未消化的组织块，进行低速离心，并加入含血清的培养液。

7. 计数：使用计数板进行细胞计数，如果细胞密度过高，则加入适量培养液调节后，分装入培养瓶中。一般要求pH处于7.2-7.4范围，培养液呈微红色。

8. 培养：将培养瓶放入37℃培养箱中，若使用CO2培养箱，则瓶口需用纱布或螺旋帽封闭，每次更换培养液时需更换新塞。

二、原代组织块培养法

1. 剪切：将组织小块放入小烧杯中，使用Hank's液进行漂洗以去掉表面血污，然后用眼科剪将其剪切至1mm大小。

2. 摆布：用弯头吸管将小块吸取并放置于培养瓶底部，应保持相互之间距离约0.5cm，每个25ml培养瓶底可放20-30块。

3. 翻转：轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，注意不要让组织块滑动，封好瓶口，并放入37℃培养箱中培养约2小时。

4. 培养：从培养箱中取出，加强培养液的覆盖，待细胞从组织块中游出数量增多后，再补加培养液。

三、贴壁细胞传代的操作步骤

1. 吸除旧培养液。

2. 加入少量的胰蛋白酶和EDTA混合液，覆盖瓶底。

3. 在培养箱中放置2-5分钟，观察细胞质回缩和细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，加入Hank's液清洗细胞，确保残余消化液被冲洗掉。

5. 用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

6. 使用计数板计数，随后将细胞悬液均分至多个培养瓶中，放入培养箱中培养。

四、悬浮型细胞传代

1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，以1000rpm离心5分钟。

2. 吸掉上清液，加入适量新鲜培养基，混合均匀后，根据稀释比例转移至新的培养瓶中，在正常培养条件下培养。

注意事项

1. 操作前请务必洗手，进入超净台后手部需用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭。试剂瓶口也要擦拭。

2. 点燃酒精灯，操作应尽量在火焰附近进行，耐热物品需经常在火焰上灼烧。

3. 操作时需准确且敏捷，以减少空气流动引起的污染风险。

4. 使用的器皿不得手动触碰工作部分，操作台面上的用品也应合理布局。

5. 瓶口开后应保持45°斜位。

6. 吸取溶液的吸管请勿混用，以确保实验的准确性与安全性。

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