蛋白质纯化是生物医疗领域的一项至关重要的技术，旨在从复杂的生物样品中提取并浓缩特定的蛋白质。以下是主要方法和注意事项的详细介绍：

选择吸附分离

这一方法利用蛋白质颗粒对特定吸附剂的不同吸附能力，以实现分离。例如，某些蛋白质可能会专门吸附于活性炭或硅藻土等吸附剂上，而其他杂质则不或仅弱吸附。通过洗脱步骤，可将目标蛋白质从吸附剂中分离出来。

亲和层析

根据蛋白质分子与特定配体的特异性结合特性，将含有目标蛋白质的样品通过装有该配体的层析柱。目标蛋白质会与配体结合，而其他杂质将随洗脱液排出。最后，通过特定洗脱液将目标蛋白质从配体中洗脱，实现纯化。

低温有机溶剂沉淀法

此方法使用可与水混溶的有机溶剂（如甲醇或乙醇），在低温下降低大多数蛋白质的溶解度使其析出。与盐析技术相比，该方法分辨率更高，但蛋白质容易变性，因此需要严格控制低温条件。

按分子大小分离

密度梯度离心

在介质中进行离心时，蛋白质沉降速率取决于其质量和密度。通过在离心管中形成连续或不连续的密度梯度，不同大小的蛋白质将在不同密度区域得到分布，从而实现分离。

凝胶过滤

这是一种柱层析方法，利用一定孔径的凝胶颗粒填充层析柱。蛋白质混合物流经凝胶柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔内，而大分子蛋白质则被排除，从而实现不同大小蛋白质的分离。

超滤

利用蛋白质分子无法通过半透膜的特性，在压力或离心力作用下，使小分子物质透过膜，而蛋白质则被截留，实现分离和浓缩的目的。

按溶解度差异分离

等电点沉淀法

在等电点时，蛋白质的净电荷为0，分子之间的静电斥力减小，聚集沉淀。通过调节溶液pH至蛋白质的等电点，可使目标蛋白质沉淀，从而实现与其他杂质的分离。

盐溶与盐析

利用特定浓度的盐溶液改变蛋白质的溶解度。在低盐浓度下，蛋白质溶解度随盐浓度增加而增大，称为盐溶；在高盐浓度下则溶解度减小，导致蛋白质沉淀析出，实现分离。

按电荷不同分离

离子交换层析

此方法基于蛋白质表面电荷与离子交换剂上电荷之间的相互作用。正电荷蛋白质将与阴离子交换剂结合，负电荷蛋白质则与阳离子交换剂结合。通过调节洗脱液的离子强度或pH值，可以依次洗脱出结合在离子交换剂上的蛋白质。

电泳分离

在电场作用下，蛋白质分子根据电荷性质和数量在凝胶或其他介质中向相反电极移动，不同蛋白质因电荷、大小和形状的不同，其迁移速度也有所不同，从而实现分离。

注意事项

在进行蛋白质纯化时，需注意以下几点以确保稳定性和活性：

• 避免样品剧烈搅动和反复冻融，尽量在冰上或冷库进行操作。
• 缓冲液成分应尽量模拟细胞内环境，保持合适的pH值和离子强度。
• 加入抗氧化剂（如DTT或β-巯基乙醇）避免蛋白质氧化。
• 使用金属螯合剂（如EDTA）防止重金属对目标蛋白的破坏。
• 使用灭菌溶液防止微生物污染。
• 控制蛋白浓度，避免过于稀薄导致聚集或变性。
• 选择合适的pH值，避免与蛋白质pI相同的缓冲液。
• 使用蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性，避免目标蛋白降解。
• 所有使用的溶液需经过022μm滤膜抽滤与脱气处理。

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